Microscopia: Tipos de microscopios

El estudio detallado que es llevado a cabo en los diferentes componentes de células y tejidos animales o vegetales [por el tamaño que poseen] requiere el uso de instrumentos que permitan ampliar más veces la imagen de las estructuras que los constituyen. Y el instrumento perfecto para lograrlo es el Microscopio.

En esta edición del Blog conocerás algunas características de los diferentes tipos de microscopios.

El instrumento que fue empleado para estudiar la célula y los tejidos, es el microscopio. 

Los microscopios (del griego mikrós, «pequeño», y skopéin, «observar») son instrumentos de óptica que nos permiten ver objetos muy pequeños o detalles estructurales imposibles de distinguir a simple vista porque están por debajo del límite de resolución [a capacidad de visualizar dos puntos próximos como dos imágenes separadas] del ojo humano [el límite de resolución del ojo humano es de alrededor de 100-200 µm].

Microscopio Óptico Compuesto

Un microscopio óptico compuesto tiene una serie de lentes y utiliza luz visible como fuente de iluminación. Es posible examinar muestras muy pequeñas, además de algunos de sus detalles más finos. 

El funcionamiento del microscopio óptico es a través de un conjunto de lentes finamente talladas forma una imagen focal definida cuyo tamaño es muchas veces mayor que el de la muestra en sí. Este aumento se logra cuando los rayos luminosos procedentes de la fuente de luz pasan a través de un condensador, que tiene lentes que dirigen los rayos de luz a través de la muestra. Desde aquí los rayos pasan al interior del lente objetivo, la lente más próxima a la muestra. La imagen de la muestra vuelve a ser ampliada por el ocular.

Microscopio LX-500 

Diferentes Microscopios

Parte de los microscopios más utilizados son los Microscopio de campo oscuro, Microscopio de contraste de fases, Microscopio de polarización, Microscopio de fluorescencia, Microscopios invertidos y Microscopio de fluorescencia.

Cada uno de ellos aporta cierta información parcial sobre las características de la muestra, es debido a ello que el utilizar diferentes tipos de microscopios para nuestra muestra nos dará información complementaria para lograr un conocimiento lo más completo posible de las estructuras. 

Primera imagen a la izquierda: Campo Claro. Segunda imagen en el centro: Campo Oscuro. Tercera imagen a la derecha: Contraste de fase.

Microscopio de campo oscuro 

Es un tipo de microscopio que cuenta con un condensador especial que dirige los rayos luminosos desde la parte lateral, de manera que ilumina la muestra oblicuamente. Las lentes del microscopio reciben solo la luz dispersada por los diferentes componentes celulares (fenómeno Tyndall), por lo que las estructuras celulares aparecen brillantes, contra un fondo oscuro. La iluminación en campo oscuro se puede realizar de dos maneras diferentes: transmitida o incidente. 

En el primer caso, la parte central del rayo de luz queda ocluida por una lámina circular colocada en su trayectoria, antes de atravesar la muestra, de tal manera que esta queda oblicuamente iluminada. Los objetos pequeños aparecen brillantes sobre un fondo oscuro o bien con un curioso efecto de bajorrelieve. Esta iluminación puede conseguirse colocando un filtro opaco circular dentro del condensador del microscopio. 

El segundo tipo de iluminación o incidente necesita de un condensador especial provisto de una superficie central en forma de parábola que refleja lateral y periféricamente la luz hacia un espejo, con la inclinación suficiente para enviar un cono de luz hacia la muestra. 

Estos condensadores proporcionan una mayor intensidad de iluminación que los convencionales, permitiendo así la observación a gran aumento. Normalmente, se usa la microscopía de fondo oscuro para la observación de células vivas y móviles, como bacterias y espermatozoides. Por ejemplo, una célula de un cultivo puede mostrar brillantes el nucléolo, la envoltura, las mitocondrias y las gotitas de lípidos, que se destacan sobre el fondo oscuro del citoplasma.

Microscopio de contraste de fases 

El microscopio de contraste de fases se basa en la existencia de pequeñas diferencias en el índice de refracción en distintas partes de cada célula y tejido; cuando la luz pasa por regiones de mayor índice de refracción, experimenta un retardo o deflexión y queda fuera de fase con respecto al haz principal de las ondas de luz. Estas diferencias de refracción no resultan evidentes con el microscopio común, pero el microscopio de contraste de fase las amplifica, con lo que hace que su intensidad sea visible, de manera que las preparaciones citológicas e histológicas puedan ser observadas sin necesidad de tinción. 

Para ello, este microscopio cuenta con una iluminación anular, debido a un diafragma con anillo de luz ubicado en el condensador. Este anillo de luz se cubre exactamente con uno de fase, que se halla en el objetivo. Por interferencia entre los rayos de luz provenientes de las diferentes regiones del objeto y aquellos influidos por el anillo de fase, se logran imágenes diferenciadas. 

Debido a sus particulares características, este microscopio permite observar células y tejidos sin necesidad de teñirlos, por lo cual es muy útil cuando interesa conocer sus estructuras in vivo.

Microscopio de polarización 

Este microscopio usa luz polarizada [luz que vibra en un solo plano] para iluminar la muestra. 

El microscopio de polarización posee un prisma polarizador de la luz, que solo deja pasar luz polarizada hacia la muestra. Otro filtro, analizador, se coloca por encima de la muestra. Ambos filtros pueden orientarse, de manera que, si sus secciones principales se cortan perpendicularmente, la luz que atraviese el polarizador no pasará a través del analizador. 

Cuando se observan materiales celulares o tisulares llamados «isotrópicos», los cuales tienen el mismo índice de refracción en todas direcciones, de manera que no modifican la luz polarizada que los atraviesa, cualquiera que sea el plano de incidencia, se ven oscuros. 

Por el contrario, las estructuras anisotrópicas, como las sustancias cristalinas y las moléculas fibrosas orientadas en forma ordenada, modifican el plano de la luz polarizada (la velocidad de propagación de la misma varía según la dirección que se considere) y envían rayos luminosos a través del analizador. 

Estas estructuras aparecen brillantes, con colores que se deben, principalmente, a las interferencias producidas por diferencias en el espesor de las preparaciones. Los materiales anisótropos se denominan también «birrefringentes», porque tienen dos índices de refracción distintos, de acuerdo a la dirección de incidencia de la luz. 

Este tipo de microscopio permite estudiar tejidos duros, tales como hueso, diente, órganos vegetales lignificados, estructuras que tengan simetría lineal (p. ej., tejido muscular, fibras de algodón) y la presencia o deposición de colágeno. Los Microscopios modernos más completos vienen provistos de un condensador universal, que permite pasar de la microscopía de campo claro a la de campo oscuro o de contraste de fases. Pueden tener también accesorios con dispositivos para la observación con luz polarizada, para interferencia (DIC) y, en algunos casos, también para epifluorescencia.

Microscopio LXPOL

Microscopios invertidos 

En los microscopios invertidos el revólver porta-objetivos se ubica debajo de la platina, y el sistema de iluminación y condensador, por encima de la misma. Esto permite contar con una amplia distancia de trabajo y poder observar células creciendo en medios de cultivo de varios milímetros de espesor. 

Generalmente se emplea la observación de contraste de fases o de interferencia diferencial. También puede disponer de una lámpara de fluorescencia y de los correspondientes filtros de excitación para realizar observaciones sobre células vivas a diferentes intervalos de tiempo (time lapse). Existe, igualmente, la posibilidad de adaptar al microscopio toda una gama de accesorios orientados a la micromanipulación y obtención de diminutas porciones de la muestra. Otra aplicación de este tipo de microscopio sería el control periódico de los cultivos celulares. También se usa para observar y manipular gametos o embriones vivos in vitro, en técnicas de fecundación asistida. 

Microscopio TCM400

Microscopio de fluorescencia 

Este tipo de microscopio permite detectar moléculas que se vuelven fluorescentes, es decir, que absorben luz de determinada longitud de onda y reemiten luz de una longitud de onda mayor. 

El microscopio de fluorescencia se caracteriza por poseer una fuente de luz de gran intensidad y dos sistemas de filtros. Uno de estos sistemas filtra la luz antes de que alcance la muestra, de modo que deja pasar solo la longitud de onda que excita las moléculas fluorescentes que se quieren visualizar. 

La muestra es visualizada a través del segundo sistema de filtros, que deja pasar solo la longitud de onda correspondiente a la luz reemitida por los componentes fluorescentes. De esta manera, las estructuras fluorescentes aparecen luminosas y brillantes, y resaltan sobre un fondo oscuro. 

Como fuente de luz puede utilizarse luz visible, de longitud de onda corta, o bien ultravioleta, lo que permite detectar moléculas que absorben dicho tipo de luz y se vuelven fluorescentes, con lo que emitirán una luminosidad que se encontrará dentro del espectro visible. Con este tipo de microscopio pueden revelarse fluorescentes naturales, como la vitamina A o la clorofila. Sin embargo, con mayor frecuencia se utiliza para detectar, en células o tejidos, la presencia de proteínas u otro tipo de moléculas a las que previamente se haya acoplado un colorante fluorescente (fluorocromo) agregado a la preparación, de manera que adquieran una fluorescencia inducida o exógena (fluorescencia secundaria). 

Las técnicas de inmunofluorescencia, que proporcionan gran especificidad y sensibilidad en la detección de moléculas en células y tejidos, se basan en la utilización de anticuerpos unidos a colorantes fluorescentes. 

En un mismo preparado pueden utilizarse dos o más fluorocromos, como, por ejemplo, la fluoresceína y la rodamina, que se vuelven fluorescentes con distinto color (verde y rojo, respectivamente). Los colorantes fluorescentes se pueden inyectar en células vivas para estudiar cambios en la localización y la concentración de moléculas específicas en el interior celular.

Microscopio LX400

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Bibliografía

Tortora J.G., Funke B.R., Case C. L. (2007). MICROBIOLOGY: An Introduction 9th Ed. Madrid España: Ed. Médica Panamericana.

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Montuenga B.L., Ruiz E.F., Calvo G.A. (2009). Técnicas en Histología y Biología Celular. Barcelona España: Elsevier España.